Inhibition of the growth of major mastitis-causing pathogens by non-aureus Staphylococcus isolates using the cross-streaking method / Comunicação: Inibição do crescimento dos principais patógenos causadores de mastite por isolados de estafilococos não aureus pelo método cross-streaking

O objetivo do presente estudo foi avaliar a capacidade de estafilococos não aureus (NAS) isolados de diferentes nichos ecológicos (leite, ambiente e ápice do teto), associados a vacas leiteiras, de inibir os principais agentes etiológicos da mastite bovina (Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis e Escherichia coli). Neste estudo, 38 isolados NAS de diferentes nichos ecológicos foram avaliados quanto à capacidade de inibir o crescimento in vitro de importantes patógenos causadores de mastite pelo método cross-streaking. No total, 19 (50%) isolados de NAS (oito isolados de S. chromogenes, 10 de S. fleurettii e um de S. haemolyticus) apresentaram inibição contra os principais patógenos causadores de mastite. No entanto, a inibição dos patógenos causadores da mastite bovina por isolados de NAS foi maior contra bactérias Gram-positivas. Além disso, o presente estudo não sugeriu que os nichos ecológicos influenciam a capacidade do NAS de inibir os principais patógenos causadores da mastite bovina. Com base nesses resultados, concluiu-se que certos isolados de NAS apresentam potencial efeito protetor contra os principais patógenos da mastite, pelo menos in vitro.(AU)

Catarrhal mastitis by Staphylococcus simulans in a nulliparous goat / Mastite catarral causada por Staphylococcus simulans em uma cabra nulipara

The present paper is a case report of a one-year old nulliparous Alpine Goat belonging to a dairy goat farm in semi-arid region of Brazil. Both glands were naturally infected by α-hemolytic Staphylococcus simulans and evolved similar clinical signs. The mammary glands presented an acute catarrhal mastitis with systemic clinical signs that responded positively to treatment with gentamicin associated with amoxicillin. The present report suggests the importance of the pathogenic potential of non-aureus Staphylococci strains (NAS) as a cause of clinical mastitis also in nulliparous animals. The isolate showed resistance to tetracycline and contained staphylococcal toxin production genes (sec, sec and TSST-1). Moreover, it has been reported that Staphylococcus simulans is an emerging pathogen in humans causing cutaneous and osteoarticular infections, mainly in those in close contact with farm animals. To the best of our knowledge, this is the first report of a clinical mastitis in a nulliparous goat caused by Staphylococcus simulans(AU)

O presente trabalho é o relato do caso de uma cabra nulípara da raça Parda Alpina, de um ano de idade, pertencente ao Setor de Caprinocultura da Universidade Federal da Paraíba ­ Bananeiras - Brasil. Ambas as glândulas foram naturalmente infectadas por Staphylococcus simulans α-hemolítico. As glândulas mamárias apresentaram mastite aguda catarral com envolvimento sistêmico, respondendo positivamente ao tratamento sistêmico com gentamicina associada a amoxicilina. O presente relato sugere a importância do potencial patogênico de Staphylococcus não-aureus (SNA) como causador de mastite clínica também em animais nulíparos. O isolado mostrou resistência a tetraciclina e continha genes de produção de toxinas estafilocócicas (sec, seg e TSST-1). Além disso, tem sido relatado que Staphylococcus simulans é um patógeno emergente em seres humanos causando infecções cutâneas e osteoarticulares, principalmente naqueles que têm contato íntimo com animais de fazenda. Até onde sabemos, este é o primeiro relato de uma mastite clínica em uma cabra nulípara causada por Staphylococcus simulans.(AU)

Antimicrobial resistance and detection of mecA and blaZ genes in coagulase-negative Staphylococcus isolated from bovine mastitis / Resistência antimicrobiana e detecção dos genes mec e blaZ em Staphylococcus coagulase-negativos isolados de mastite bovina

The present study evaluated the pheno- and genotypical antimicrobial resistance profile of coagulase-negative Staphylococcus (CNS) species isolated from dairy cows milk, specially concerning to oxacillin. Of 100 CNS isolates, the S. xylosus was the prevalent species, followed by S. cohnii, S. hominis, S. capitis and S. haemolyticus. Only 6% were phenotypically susceptible to the antimicrobial agents tested in disk diffusion assay. Penicillin and ampicillin resistance rates were significantly higher than others antimicrobials. Four isolates were positive to mecA gene (4%), all represented by the S. xylosus species. The blaZ gene was detected in 16% of the isolates (16/100). It was noticed that all mecA + were also positive to this gene and the presence of both genes was correlated to phenotypic beta-lactamic resistance. We conclude that CNS species from bovine milk presented significantly distinct antimicrobial resistance profiles, evaluated by phenotypic and genotypic tests, which has implications for treatment and management decisions.

O presente estudo avaliou o perfil fenogenotípico de resistência aos antimicrobianos em espécies de Staphylococcus coagulase-negativo (ECN) isoladas do leite de vacas com mastite, em especial considerando a oxacilina. Dos 100 isolados de ECN, S.xylosus foi a espécie predominante, seguida por S. cohnii, S. hominis, S. capitis and S. haemolyticus Apenas 6% dos isolados foram fenotipicamente suscetíveis aos agentes antimicrobianos testados no ensaio de difusão em disco. O percentual de resistência à penicilina e ampicilina foi significativamente maior que aos outros antimicrobianos. Quatro isolados foram positivos para o gene mecA (4%), sendo todos representados pela espécie S.xylosus. O gene blaZ foi detectado em 16% dos isolados (16/100), sendo todos mecA positivos e a presença de ambos os genes foi correlacionada com a resistência fenotípica aos beta-lactâmicos. Foi possível concluir que as espécies de ECN provenientes de leite bovino apresentaram distintos perfis de resistência antimicrobiana, avaliados por testes fenotípicos e genotípicos, podendo dificultar a adoção de medidas de tratamento e manejo dos animais.

Caracterização molecular dos mecanismos de resistência à linezolida em estafilococos coagulase-negativos e estudo da estabilidade do fenótipo resistente / Linezolid resistance in negative-coagulase staphylococci: characterization and stability of resistant phenotype

Linezolid was the first agent of the oxazolidinone class to be introduced clinically. This oxazolidinone inhibits protein biosynthesis by preventing the formation of the initiation complex that consists of the mRNA, the f-Met tRNA and the 50S subunit of the ribosome. Although linezolid resistance has been mediated by the cfr-encoded product or by ribosomal proteins (L3, L4 and L22), the most common mechanism of resistance involves mutations in the central loop of domain V of the 23S rRNA gene. From March 2008 to December 2011, 38 coagulase-negative staphylococci (CNS) strains (20 S. epidermidis, 14 S. haemolyticus, 3 S. hominis e 1 S. warneri) exhibiting resistance to linezolid were isolated from blood and catheter cultures from patients in two tertiary care hospitals in the State of São Paulo and were included in this study for the ascertainment of the resistance mechanisms to this antimicrobial agent and for the analysis of the stability of this resistance. The strains exhibited high-level resistance to linezolid (MICs 16-128 µg/ml) and all were multidrug resistant, remaining susceptible to vancomycin and teicoplanin. The G2576T mutation in domain V region of 23S rRNA was identified in all isolates, except in a linezolid-resistant S. haemolyticus strain. The cfr gene and mutations in ribosomal proteins L4 and L22 were not detected. Regarding L3 protein analysis, all S. epidermidis strains of hospital A, including the linezolid-susceptible control strain, showed the L3 Leu101Val mutation, suggesting that this alteration is probably not involved in linezolid resistance. The one strain from hospital B (S. epidermidis) was wild-type for this ribosomal protein. Only one S. haemolyticus strain had a mutation in the L3 protein, Val154Leu. Two S. hominis strains showed Gly139Arg/Met156Thr mutations whereas one strain had Phe147Ile in L3 protein. The identification of these mutations in L3 protein of the linezolid-resistant S. haemolyticus and S. hominis strains strengthens the role of these sites in the acquisition of linezolid resistance in Staphylococcus spp. However, the presence of G2576T in the 23S rRNA gene makes difficult to determine exactly the role of L3 mutations in conferring elevated linezolid MIC values showed by these clinical strains. In the absence of antibiotic pressure, after 130 passages, linezolid resistance was stable in the clinical strains of this study, which did not have all copies of the 23S rRNA gene mutated, according to the restriction of the domain V fragment with NheI enzyme. Sequencing of the individual copies of the 23S rRNA gene in the serially passaged strains showed G2576T in all amplified copies by PCR: 4/4 and 5/5 in S. epidermidis and 3/3 in S. haemolyticus strains (MIC of 16-32 µg/ml). The stability of the mutant rRNA copy was also observed in the linezolid-susceptible S. epidermidis strain (MIC of 4 µg/ml). After the passages in antibiotic-free medium, the linezolid MIC of this strain fell to 1 µg/ml and the G2576T mutation persisted in one 23S rRNA gene copy. The clonal relatedness of the strains was determined by PFGE and revealed a clonal dissemination of different CNS species. Regarding MLST analysis, all S. epidermidis strains belonged to the sequence type ST2 (CC2). Most likely, the increased selective pressure has contributed to the selection of endemic linezolid-resistant CNS clones showing the G2576T mutation that have been disseminated in the institution A since 2008. Differently, the restricted use of linezolid in the institution B could explain the occurrence of a single resistant strain since 2005

Caracterização molecular dos mecanismos de resistência à linezolida em estafilococos coagulase-negativos e estudo da estabilidade do fenótipo resistente / Linezolid resistance in negative-coagulase staphylococci: characterization and stability of resistant phenotype

Linezolida foi o primeiro fármaco da classe das oxazolidinonas a ser aprovado para o uso clínico. Esta nova oxazolidinona inibe a síntese protéica impedindo a formação do complexo de iniciação formado pelo mRNA, tRNA f-Met e a subunidade 50S do ribossomo bacteriano. Embora a resistência à linezolida possa ser mediada pelo produto do gene cfr ou por mutações nas proteínas ribossômicas L3, L4 e L22, o mecanismo de resistência mais comum envolve mutações no domínio V do gene rRNA 23S. Entre março de 2008 a dezembro de 2011, 38 cepas de estafilococos coagulase-negativos (SCNs) resistentes à linezolida (20 S. epidermidis, 14 S. haemolyticus, 3 S. hominis e 1 S. warneri) isoladas de hemoculturas e pontas de cateter de pacientes internados em dois hospitais terciários do Estado de São Paulo foram incluídas neste estudo para a determinação dos mecanismos de resistência e análise da estabilidade do fenótipo resistente. As cepas de SCNs apresentaram altos níveis de resistência à linezolida (CIMs de 16-128 µg/ml) e foram multi-resistentes, permanecendo sensíveis à vancomicina e teicoplanina. A mutação G2576T foi identificada no domínio V do gene rRNA 23S em todas as cepas de SCNs, exceto em uma cepa de S. haemolyticus. O gene cfr e mutações nas proteínas L4 e L22 não foram detectados. Em relação à proteína L3, todas as cepas de S. epidermidis do hospital A, incluindo a cepa controle sensível à linezolida, apresentaram a substituição Leu101Val, sugerindo que essa mutação seja um marcador clonal dessa população sem envolvimento com a resistência à linezolida. A única cepa proveniente do hospital B (S. epidermidis) foi selvagem para essa proteína ribossômica. Somente uma cepa de S. haemoyticus teve uma mutação no gene rplC, resultando na alteração Val154Leu. Em S. hominis, a mutação Phe147Ile foi identificada em uma cepa, enquanto a associação de Gly139Arg e Met156Thr foi observada nas outras duas cepas dessa espécie. A identificação dessas mutações na proteína L3 de...

Linezolid was the first agent of the oxazolidinone class to be introduced clinically. This oxazolidinone inhibits protein biosynthesis by preventing the formation of the initiation complex that consists of the mRNA, the f-Met tRNA and the 50S subunit of the ribosome. Although linezolid resistance has been mediated by the cfr-encoded product or by ribosomal proteins (L3, L4 and L22), the most common mechanism of resistance involves mutations in the central loop of domain V of the 23S rRNA gene. From March 2008 to December 2011, 38 coagulase-negative staphylococci (CNS) strains (20 S. epidermidis, 14 S. haemolyticus, 3 S. hominis e 1 S. warneri) exhibiting resistance to linezolid were isolated from blood and catheter cultures from patients in two tertiary care hospitals in the State of São Paulo and were included in this study for the ascertainment of the resistance mechanisms to this antimicrobial agent and for the analysis of the stability of this resistance. The strains exhibited high-level resistance to linezolid (MICs 16-128 µg/ml) and all were multidrug resistant, remaining susceptible to vancomycin and teicoplanin. The G2576T mutation in domain V region of 23S rRNA was identified in all isolates, except in a linezolid-resistant S. haemolyticus strain. The cfr gene and mutations in ribosomal proteins L4 and L22 were not detected. Regarding L3 protein analysis, all S. epidermidis strains of hospital A, including the linezolid-susceptible control strain, showed the L3 Leu101Val mutation, suggesting that this alteration is probably not involved in linezolid resistance. The one strain from hospital B (S. epidermidis) was wild-type for this ribosomal protein. Only one S. haemolyticus strain had a mutation in the L3 protein, Val154Leu. Two S. hominis strains showed Gly139Arg/Met156Thr mutations whereas one strain had Phe147Ile in L3 protein. The identification of these mutations in L3 protein of the linezolid-resistant S. haemolyticus and S. hominis strains...

Staphylococcus lugdunensis: um olhar diferenciado no laboratório clínico / Staphylococcus lugdunensis: a different view in the clinical laboratory

Os estafilococos coagulase negativos (ECNs) são cocos Gram-positivos usualmente considerados contaminantes em laboratórios de microbiologia clínica. Apesar de pertencer a este grupo, Staphylococcus lugdunensis pode causar infecções complicadas, como endocardites, infecções de pele e tecidos moles, osteomielites, entre outras. Além da formação de biofilmes, apresenta patogenicidade similar ao Staphylococcus aureus. É um dos principais agentes causadores de endocardites, com taxa de mortalidade de até 70 por cento. Pode ser confundido com S. aureus quando se utilizam testes rápidos para sua identificação, como a pesquisa de clumping factor, no caso de teste de coagulase em lâmina, ou em testes de aglutinação direta em látex. Pode ser facilmente identificado por meio de provas bioquímicas acessíveis, como a presença de atividade da ornitina descarboxilase e pirrolidonil arilamidase (PYR). Apresenta sensibilidade à maioria dos agentes antimicrobianos, devendo ser pesquisada rotineiramente a presença de betalactamases e do gene mecA por meio de testes com cefalosporina cromogênica e suscetibilidade à cefoxitina, respectivamente. Convém salientar que os critérios interpretativos utilizados para avaliar a sensibilidade à cefoxitina são os mesmos preconizados para S. aureus e diferentes dos utilizados para os outros ECNs. Apesar de incomum, o S. lugdunensis é um patógeno com acentuada virulência que deve ser corretamente identificado, pois raramente poderá ser considerado contaminante quando isolado de sítios estéreis.

Coagulase-negatives staphylococci (CNS) are Gram-positives cocci commonly regarded as contaminants in clinical microbiology laboratories. Despite belonging to this group, Staphylococcus lugdunensis may cause complicated infections such as endocarditis, skin infections and soft tissue, osteomyelitis, among others. Apart from the formation of biofilms, it has pathogenic features similar to Staphylococcus aureus. It may be mistakenly identified as S. aureus when using rapid identification tests, such as clumping factor in slide coagulase or in agglutination latex tests. It is easily identified through available biochemical tests, such as the presence of ornithine decarboxylase and pyrrolidonyl arylamidase (PYR). It presents sensitivity to most antimicrobial agents. Furthermore, the presence of beta-lactamase and mecA gene should be routinely investigated by testing with chromogenic cephalosporin and cefoxitin susceptibility, respectively. It is convenient to highlight that the interpretative criteria used to evaluate cefoxitin sensitivity are the same recommended for S. aureus and different from those used for other CNS. Despite the fact it is atypical, S. lugdunensis is a virulent pathogen, which must be accurately identified insofar as it will rarely be deemed as a contaminant when isolated from sterile sites.

Uso de PCR e sequenciamento do rDNA 16S para identificação de bactérias do gênero staphylococcus isoladas de mastite bovina / Identification of staphylococcus strains isolated from bovine mastitis by PCR and 16S rDNA sequencing

O objetivo deste trabalho foi identificar espécies de Staphylococcus (n=100) isoladas de mastite em rebanhos bovinos do Estado de Minas Gerais. Para esta finalidade foram utilizadas reações de PCR empregando oligonucleotídeos iniciadores descritos anteriormente para amplificar genes específicos de S. aureus (femA), S. intermedius (rDNA 16S) e S. hyicus (rDNA 16S-23S) e o sequenciamento do rDNA 16S. De acordo com as reações de PCR, 83 isolados foram identificados como S. aureus, 13 isolados como S. intermedius, dois como S. hyicus e dois isolados não foram identificados. Foram submetidos ao sequenciamento do rDNA 16S seis isolados identificados como S. aureus e os 17 restantes. Os seis isolados identificados como S. aureus confirmaram essa identificação. Dos outros 17 isolados, 13 foram identificados como S. chromogenes e quatro como S. hyicus, com similaridade igual ou superior a 99%. Baseando-se nos resultados da reação de PCR do gene femA e do sequenciamento do rDNA 16S, foram identificados 83 S. aureus, 13 S. chromogenes e quatro S. hyicus. Neste estudo os oligonucleotídeos iniciadores empregados na reação de PCR para S. intermedius não foram específicos, pois amplificaram também S. chromogenes; e os empregados na reação de PCR para S. hyicus não foram sensíveis, pois falharam na identificação de dois isolados de S. hyicus. A identificação definitiva das duas últimas espécies somente foi possível pelo sequenciamento do rDNA 16S.

The objective of this study was to identify the species of 100 isolates of Staphylococcus from mastitis in dairy cows from herds located in the state of Minas Gerais, Brazil. PCR reactions were carried out using specific primers described previously for S. aureus (femA gene), S. intermedius (16S rDNA) and S. hyicus (16S-23S rDNA spacer region). In addition, products of amplification of variable regions of the 16S rDNA gene of the strains were sequenced. According to the results of the PCR, 83 strains were identified as S. aureus, 13 as S. intermedius, two as S. hyicus and two isolates were not identified. The sequencing of 16S rDNA was applied to 23 strains identified by PCR amplifications: six S. aureus and the strains identified as S. intermedius (n=13), S. hyicus (n=2) or not identified (n=2). The sequencing of 16S rDNA confirmed the six strains as S. aureus. The others 17 strains were identified as S. chromogenes (13 isolates) and S. hyicus (four isolates). Each sample was related to a specie according to the smallest E-value and highest similarity (≥ 99%). The identification of S. hyicus and S. chromogenes was accomplished only by 16S rDNA sequencing.

Caracterização fenotípica da resistência a antimicrobianos e detecção do gene mecA em Staphylococcus spp. coagulase-negativos isolados de amostras animais e humanas / Phenotypic characterization of antimicrobial resistance and detection of the mecA gene in coagulase-negative Staphylococcus spp. isolates from animal and human samples

Os estafilococos coagulase-negativos (ECN) fazem parte da microbiota normal da pele e, apesar de terem sido considerados saprófitas por muito tempo, o seu significado clínico como agente etiológico tem aumentado com o passar dos anos. Neste estudo, foram obtidos 72 isolados de ECN a partir de amostras do conduto auditivo de cães, de mastite bovina e de infecções humanas. Staphylococcus xylosus foi o microrganismo mais isolado, nas amostras animais, e S. cohnii subsp. cohnii em humanos. Os isolados foram avaliados de modo a traçar o perfil fenotípico de sua resistência aos antimicrobianos mais indicados no tratamento de infecções estafilocócicas. Foi detectado um elevado nível de resistência à penicilina e ampicilina. A gentamicina, a vancomicina e a associação ampicilina+sulbactam foram eficientes frente aos isolados testados. A resistência à oxacilina foi avaliada por meio dos testes de difusão em disco modificada, ágar screen, microdiluição em caldo e diluição em ágar para constatar, se à semelhança do que ocorre com os estafilococos coagulase-positivo, esta pode ser mediada pelo gene mecA e apresentada de forma heterogênea. A presença do gene mecA foi determinada pelo método da Reação em Cadeia de Polimerase (PCR), sendo 5,6 por cento dos isolados mecA positivos.

Coagulase-negative staphylococci (SCN) make part of the normal microbiota skin and although they have been considered saprophytics for years, nowadays their clinical significance as an etiologic agent has increased. In this study, 72 SCN isolates obtained from external ear canals of dogs, bovine mastitis and human nosocomial infections were evaluated. Staphylococcus xylosus was the most prevalent microorganism in animal samples and S. cohnii subsp. cohnii in human samples. SCN isolates were evaluated in order to establish a phenotypical resistance pattern towards the most indicated antibiotics for staphyloccocal infections. A high level of resistance to penicillin and ampicillin was detected. The most efficient antibiotics evaluated were gentamicin, vancomicin and the association between ampicillin and sulbactam. To certify the heterogeneous resistance pattern, oxacillin resistance was phenotypically detected by a modified-disc-diffusion test, agar screen, broth micro-dilution and agar dilution. The presence of the mecA gene was detected in 5.6 percent of the SCN isolates by Polimerase Chain Reaction (PCR).

Suscetibilidade de estafilococos coagulase-negativos de significado clínico aos agentes antimicrobianos / Antimicrobial susceptibility of coagulase-negative staphylococci of clinical significance

Os estafilococos coagulase-negativos são responsáveis por uma série de doenças humanas e a resitência de várias espécies aos antibióticos tem sido relatada. Determinamos a suscetibilidade de 141 cepas à novobiocina e a um painel de 17 agentes anti-microbianos pelo método de difusão em meio sólido. Uma percentagem elevada (71,6%) das cepas foram resistentes à penicilina e em menor grau à ampicilina (42,5%), tetraciclina (35,4%), cloranfenicol (30,4%, meticilina (29%) e oxacilina (26,9%). Um número de cepas mostraram-se resistentes à cefalotina, carbenicilina, clidamicina e aminoglicosideos. A co-resistência para pares de agentes antimicrobianos ocorreu para penicilina-ampicilina, oxacilina-meticilina e tetraciclina-cloranfenicol. Dezessete padrões de multiresistência foram observados e as espécies foram resistentes a 5 e até a 16 antibióticos.